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黃曲霉毒素分析-HPLC檢測對比實驗

一、介紹

黃曲霉毒素是由生活在熱帶或亞熱帶地區的黃曲霉,寄生曲霉和曲霉等微生物產生的一組霉菌毒素,具有強烈的致癌作用。據報道,經常發現黃曲霉毒素含量較高,超過食品安全機構(如FDA)在各種食品(包括水果,豆類,谷物和香料)中規定的安全水平。

目前的法規要求總黃曲霉毒素(黃曲霉毒素B1,B2,G1和G2的總和)必須低于10μg/ kg。本次實驗使用三氟乙酸(TFA)與HPLC結合熒光檢測的柱后衍生法進行黃曲霉毒素分析。該方案可大大提高檢測黃曲霉毒素B1和G1的靈敏度。度除衍生方法外,多功能柱或免疫親和柱的使用可用于提高樣品制備過程中的再現性和回收率。

二、試驗

●   常規HPLC

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●   UHPLC

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●   結構體

黃曲霉毒素B1,B2,G1和G2是產生天然熒光的化合物。然而,B1和G1的熒光強度與B2和G2的熒光強度相比要小得多,因此,必須通過使用TFA衍生化從天然形式轉變為羥基化形式來提高黃曲霉毒素B1和G1分析的靈敏度。黃曲霉毒素B1,B2,G1和G2的結構以及衍生的B1和G1的結構如圖所示:

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圖1.黃曲霉毒素B1,B2,G1,G2和TFA衍生的B1和G1的結構

●   Derivatizaton

黃曲霉毒素和實際樣品的標準混合物的TFA衍生化程序如圖所示:

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圖2. TFA衍生化
* 1為了避免黃曲霉毒素吸附到容器內壁上,必須用乙腈和Milli-Q水沖洗容器,然后干燥。


●   樣品制備

選擇玉米粗粉和烤花生作為測試樣品,并使用多功能柱用于玉米粗粒的樣品制備,而免疫親和柱用于制備烤花生。樣品制備程序如圖3所示。

1.玉米糠
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2.烤花生

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* 1在恢復估計試驗中,將使用在重鉻酸鹽/ Milli-Q水(90/10)中的黃曲霉毒素(各自為0.5 11g / L)的標準混合物。
* 2多功能柱中有三種分離模式(反相,正相和離子交換)。(RomerLabs)
* 3免疫親和柱(HORIBA)利用抗黃曲霉毒素單克隆抗體和黃曲霉毒素之間的獨特結合能力。
* 4讓色譜柱平衡至室溫。小心地在上蓋上的孔上打孔,使空氣不會進入凝膠,然后取上蓋和下蓋。
* 5用0.20克氯化鉀,0.20克磷酸二氫鉀,1.16克磷酸氫二鈉和8.0克氯化鈉(pH7.4)至1升配制Milli-Q水溶液。
* 6小心沖洗色譜柱,使空氣不會進入凝膠。
* 7最大限度地減少乙腈中最終洗脫液的含水量。如果最終洗脫中的水含量相對較高,則消除溶劑需要更長的時間,這可能導致黃曲霉毒素的變性。
* 8完全從凝膠中釋放相互作用的黃曲霉毒素。


三、結果

黃曲霉毒素分析實驗結果顯示:TFA衍生的黃曲霉毒素(各自為5.0μg/ L)的標準混合物的色譜圖如圖4所示[通過常規HPLC(上部),通過UHPLC(下部)]。通過常規HPLC在12分鐘內完成分離,并在3.5分鐘內通過UHPLC完成分離。

黃曲霉毒素的標準混合物的線性范圍為0.5至10μg/ L,常規HPLC和UHPLC均具有優異的相關性r2。

對于常規HPLC,在峰值保留時間和面積上分別具有優于0.2%RSD和3%RSD的良好再現性,包括TFA衍生化程序(N = 6)。UHPLC還具有良好的重現性,峰值保留時間和面積分別具有優于0.2%的RSD和3.5%的RSD。將1.0ug / L的黃曲霉毒素標準混合物用于該估計。

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圖4.黃曲霉毒素標準混合物的色譜圖(每種5.0μg/ L,TFA衍生化)1 =黃曲霉毒素G1,2 =黃曲霉毒素B1,3 =黃曲霉毒素G2,4 =黃曲霉毒素B2

使用樣品制備中的多功能柱(MycoSep 226AflaZon +)制備的玉米粗粒樣品的色譜圖顯示在圖5中(常規HPLC和UHPLC)。來自玉米粗粒的樣品和摻有黃曲霉毒素的標準混合物的樣品用于黃曲霉毒素的恢復估計。在色譜圖中幾乎沒有觀察到污染物峰,并且對于常規HPLC和UHPLC都獲得了標準黃曲霉毒素的良好回收率,分析結果如表1所示。

在樣品制備中使用免疫親和柱(AFLAKING)制備的烤花生樣品的色譜圖顯示在圖6中(常規HPLC和UHPLC)。來自烤花生的樣品和摻有黃曲霉毒素標準混合物的樣品用于黃曲霉毒素的恢復估計。在色譜圖中幾乎沒有觀察到污染物峰,并且對于常規HPLC和UHPLC都獲得了標準黃曲霉毒素的良好回收率,分析結果如表2所示。
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圖5.來自玉米粒的純化溶液的色譜圖1 =黃曲霉毒素G1,2 =黃曲霉毒素B1,3 =黃曲霉毒素G2,4 =黃曲霉毒素B2
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圖6.來自烤花生的純化溶液的色譜圖1 =黃曲霉毒素G1,2 =黃曲霉毒素B1,3 =黃曲霉毒素G2,4 =黃曲霉毒素B2
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表1.標準黃曲霉毒素的回收率[%]


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